Electroforesis

[pfdc]

Tengo ganas de jugar un poco con la separacion de proteinas por electroforesis. Hay alguien por ahi con experiencia y/o que sepa donde conseguir agar, micropipetas, solucion tampon y todo el material necesario?
PFDC

[anajesusa]

Hola profe, por acá hago electroforesis casi de rutina, uso una fuente casera regulada de 150v (será vieja que esta regulada con una VR150 ), la cuba es de acrílico y uso un buffer de veronal sódico. El lugar donde se hace la siembra se compra y es acetato de celulosa, el instrumento para hacer la siembra se puede comprar, pero sale un ojo de la cara yo he fabricado uno con una aguja de hipodérmica gruesa, se le rebaja la cánula cuestión que quede mediacaña se dobla de manera que quede fácil de apoyar.
La corrida a ese voltaje tarda mas o menos 50 minutos luego se colorea con Fat red 7B o negro sudan. Acido acético y metanol se usan como decolorantes y para cuantificar se pueden cortar las bandas y eluirlas, luego se miden las densidades ópticas de cada banda.

Editado: Perdón el colorante para proteínas es Negro amido 10B, el Fat red 7B que mencione arriba es para electroforesis de lípidos, o lipidogramas

[pfdc]

Bueno, como es que no has redactado un documento sobre electroforesis amater y lo has puesto a disposicion de todos. ¿Que pasa? te guardas los conocimientos solo para ti o que.
Asi que ya estas largando, que por aqui somos todo oidos.

PFDC

[anajesusa]

Bueno, sabes que no me guardo las cosas, prepararé el documento, en algún momento con aewolframio tocamos en el foro algo de esto.
Aquí pongo algunas corridas, la tercera es de un paciente que que tiene una gamapatía monoclonal (linfoma) los otros, digamos son lo que uno encuentra a diario en el laboratorio, normales. La banda gruesa de la derecha (+) corresponde a las albúminas, el resto de las bandas son las globulinas.
Aclaro que esas corridas no son de las mejores, siempre la mejor va en el protocolo de informe al paciente, esas son algunas que han quedado.
El porcentaje de cada banda puede sacarse ademas de por elución como dije antes,con un densitómetro, un aparatejo bastante caro.
En unos días te pongo el documento que requieres profe

[pfdc]

Ya se que no te guardas nada, era de broma, aqui en España decimos para picarte .
Unas preguntas:
En internet encuentro que emplean como base agarosa, que ventaja tiene el acetato de celulosa?
EIgualmente para revelar las corridas ( menudas similitudes se le ocurres a uno con este nombre... uff ) en lo que he leido emplean el bromuro de etidio y luz ultravioleta como agente de tincion, que ventajas tiene esto sobre los colorantes que tu propones?.
PFDC

[anajesusa]

Mira, yo no tengo experiencia con la agarosa, este soporte se usa mas bien para ADN, moléculas grandes de unos 20000 nucleótidos.
Lo que yo a hago es el fraccionamiento de proteínas plasmáticas, el cellogel (acetato de celulosa gelatinizado) resulta bueno en esto porque tiene muy buena definición de bandas y puede conservarse y adosarse al informe, por medio de un proceso de transparentización te queda como una cinta, que es lo que he puesto en la fotografía.
Hacer ácidos nucleicos es mucho mas complejo y requiere de hibridaciones y demás, que no están a la altura de un laboratorio común de análisis clínicos como el mío.

[anajesusa]

Bueno profe acá pongo el documento, esto esta muy al alcance de cualquiera, salvo la cuantificación que requiere espectrofotómetro el resto es muy simple. Va el documento que también pondré en mi blog

Electroforesis en acetato de celulosa (Cellogel)

Fundamento teórico

Es un método para fraccionar mezclas proteicas, tal como lo es el suero sanguineo, como las moléculas tienen distinta movilidad cuando son sometidas a la acción de un campo eléctrico, separándose en fracciones. El buffer o tampón que se use para la corrida es fundamental, porque de él va a depender la carga neta de las moléculas, de su pH. Otros factores importantes son el tamaño de la molécula, la intensidad de corriente utilizada y la temperatura.
Nota: No es que las proteínas en realidad tengan carga, tienen carga neta cero en su punto isoeléctrico, pero a determinado pH hay grupos ionizables principalmente COO- y NH3+ que le dan esa carga necesaria para el fraccionamiento.

Materiales a utilizar

Una fuente de unos 150 DCV 100 mA
Una cuba electroforética (ver foto) esta es comprada, pero puede fabricarse fácilmente con acrílico, son dos compartimentos separados sobre la separación va montado un puente de acrílico también donde se monta el cellogel
Aplicadores o sembradores El mío esta hecho casero con una aguja de hipodérmica de las gruesas, con el dremel le rebajé la cánula hasta dejarla media caña (ver foto), tiene un tamaño de 0.7 cm, por cada tira de 2 cm de ancho largo dos siembras de la misma muestra, una para eluir y la otra para presentar en el informe





Reactivos

Tiras de cellogel se compran en lugares donde venden insumos para laboratorios de análisis clínicos, vienen en sobres que contiene un líquido, una vez abiertas deben conservarse en un frasco con metanol al 40%, si se secan no sirven más.

Buffer: hay muchas fórmulas, la que yo uso es la de veronal sódico al 0.04M,
Veronal sódico 8.24gr
Agua desestilada csp 1000 ml de solución
Conviene preparar menos, el buffer se puede usar muchas veces, una vez hecha la corrida se guarda en un frasco bien tapado para la próxima, el único problema es que puede contaminarse con hongos.

Liquido colorante Esta solución también puede usarse muchas veces, una vez coloreada la corrida se guarda en un frasco bien tapado
Negro amido 10B 0.5 gr
Metanol 45 ml
Ac Acético 10 ml
Agua 45 ml

Liquido decolorante
Metanol 47.5 ml
Ac Acético 5 ml
Agua 47.5 ml

Solución transparentizadora:
Metanol 85 ml
Acético 14 ml
Glicerina 1 ml

Liquido para eluir
Acetico al 80%

Método
Se toma una tira de cellogel y se la seca entre dos papeles tipo tissue, luego se la coloca en un recipiente que tenga buffer, se la deja durante unos 10 minutos, transcurridos, se la saca y se absorbe el exceso con papel tissue, se la monta sobre el puente de la cuba con la cara opaca hacia arriba, las tiras vienen con un corte en chanfle en una de sus esquinas, ese chanfle debe estar al lado derecho del operador.
La siembra se hace a 1,5 cm del cátodo, con el aplicador antes descrito. Conviene ser rápido en todo esto para evitar que se evapore el líquido del acetato y se reseque
En la cuba se coloca en ambos compartimentos una buena cantidad de buffer. Y se pone el puente con la tira.
Se enciende la fuente, si es regulable se le da unos 150v y la corriente andará mas o menos a 1 mA por cada cm de ancho de la tira, en mi caso uso tiras de 2 cm.
Se deja 50 minutos. Si se quiere visualizar por donde anda la corrida al suero puede agregarsele una tintura (azúl de bromofenol en alcohol al 1%)
Transcurrido el tiempo se desconecta la fuente de la red y se saca la tira, ojo si se manipula, las manos deben estar bien limpias y desengrasadas. Se traslada la tira cortándole ambos extremos (dejamos solo la parte donde se encuentra el suero ya fraccionado) a un recipiente con el líquido colorante por unos 4 minutos, luego se trasvasa el liquido a su frasco y la tira puede lavarse con agua de la canilla, se la pasa luego a un recipiente con liquido decolorante, agitándola y haciendo sucesivos lavados hasta que quede el fondo completamente blanco, en este momento ya se visualizan perfectamente las fracciones, pero falta transparentizar
Antes de pasar al líquido trasparentizador conviene por 1 minuto colocar en metanol puro, luego se pasa al líquido trasparentizador por 2 minutos, una vez hecho esto, se saca con precaución la tira y se la coloca sobre un vidrio cuidando que no queden burbujas de aire, se pone sobre alguna superficie caliente, puede ser el calor de una lámpara eléctrica, (yo lo hago directamente sobre la llama, pero ojo porque puede prenderse y chau trabajo, hay que empezar de nuevo). Una vez que se le aplica calor la tira se pone transparente se la deja secar y ya tenemos nuestra corrida electroforética.

Interpretacion


De total de las proteínas humanas cuyo valor normal en suero es de 6 a 8 gr/dl los porcentajes de las fracciones corresponden a:
Fracciones Valores de referencia % Valores de referencia g/dl
Albúmina 48,4 – 66,1 3,39-4,63
Alfa 1 2,6 – 6,3 0,18 – 0,44
Alfa 2 7,1 – 13,6 0,50 – 0.95
Beta 7,5 – 14,3 0,52 – 1,00
Gama 8,7 – 23,7 0,61 – 1,66
Para realizar el cálculo porcentual de las distintas fracciones se puede hacer con un densitómetro, pero también se puede hacer por elusión que es lo que voy a explicar a continuación.
Se corta la corrida de acuerdo a las líneas que he marcado, digamos en los valles:

Se preparan 6 tubos de ensayo numerados del 1 al 6 al primero se le agregan 10 ml de acético al 80% y a cada uno de los restantes 5 ml, el corte nro 1 se coloca en el primer tubo el 2 en el segundo y asi hasta el quinto, al último tubo se le agrega un trozo de tira como la nro 6, que se usará de blanco. Se agita hasta que los trocitos se hayan disuelto
Para cuantificar se necesita un espectrofotómetro, se pone a cero con el tubo 6 y se leen las densidades ópticas de cada tubo a 620 nm, se anota cada valor, al primer tubo se lo multiplica por dos (tiene el doble de eluyente) se suman todos los valores, ese valor corresponde al 100% luego regla de 3 simple se calculan los porcentajes de las distintas fracciones.

Síntesis del proceso

1. Colocar el cellogel 10 minutos en buffer
2. Llenar la cuba con buffer
3. Hacer la siembra del suero del lado opaco de la tira a 1.5 cm del lado negativo de la cuba
4. Por 50 minutos dar 150v
5. Colocar en liquido colorante 4 minutos
6. Lavar con agua de la canilla
7. Decolorar con liquido decolorante
8. Pasar a metílico por 1 minuto
9. Colocar en solución transparentizadora 2 minutos
10. Colocar en un vidrio sobre alguna superficie caliente hasta total transparencia
11. Dejar secar y eluir si se desea

Avisos y advertencias

1. El alcohol metílico es muy venenoso, se absorbe por piel y mucosas asi que trabajar con guantes y ni se les ocurra darse un traguito, porque pasan derecho al hospital, lo bueno es que para curarlos de la intoxicación con metílico se les da vodka, whisky o alguna otra bebida blanca, para que el etílico compita con el metílico, ya ven que no todos los remedios son horribles je je

2. No meter las manos en la cuba cuando esta enchufada a la red, si la fuente tiene miliamperímetro fijarse que este en cero antes de tocar.

3. Los materiales como sueros o plasmas si no sabemos bien su procedencia pueden tener enfermedades muy peligrosas HIV, hepatitis A, B, C o D etc conviene ser muy cauteloso en su manejo

[aewolframio]

Excelente reporte de procedimiento, te felicito.

[Sergi]

Buen trabajo Cesar!!

[anajesusa]

Gracias muchachos.
Un abrazo