Convertir microscopio electrónico de barrido en de transmisión.

[Diego Gonzalez]

Joer. Buen trabajo... Habra que probar

¿Has probado otras cosas?, ¿o aún estas en ello?

Lo del uranio y el osmio ya me descoloca jejejej

¿Hay que metalizar la muestra? (Efecto carga, repulsión del haz que atraviesa etc) tengo duda

Saludoss!!

[pfdc]

El acetato de uranilo (UO2(CH3COO)2·2H2O) es un sólido amarillento formado por cristales tetraédricos con un olor levemente acético. Se emplea para efectuar tinciones negativas en microscopía electrónica; de hecho, la mayor parte de las técnicas de esta microscopía requieren de este compuesto, especialmente para el contraste de muestras.

El OsO4 es un agente de tinción ampliamente usado en microscopía electrónica de transmisión (TEM) para proveer contraste a la imagen. Como tintor de lípidos, es útil también en la microscopía electrónica de barrido (SEM) como alternativa al recubrimiento metalizado. Se incorpora un metal pesado directamente en las membranas celulares, creando una alta emisión secundaria de electrones sin la necesidad de cubrir la membrana con una capa de metal, que puede obscurecer detalles de la membrana celular. En la tinción de la membrana plasmática, el tetróxido de osmio enlaza regiones de cabeza de fosfolípidos, creando así contraste con el protoplasma (citoplasma) vecino. Adicionalmente, el tetróxido de osmio es usado también para fijar muestras biológicas en conjunción con HgCl2. El OsO4 estabiliza muchas proteínas transformándolas en geles sin destruir características estructurales. Las proteínas de tejidos que son estabilizadas por el OsO4 no son coaguladas por alcoholes durante la deshidratación.

5.5.1.-Microscopía electrónica de transmisión

La resolución que se puede lograr con el microscopio electrónico depende del espesor del corte del tejido y de factores que determinen el contraste. Si el corte es grueso se enmascaran los detalles finos, los cuales se hacen cada vez más imperceptibles y oscuros debido a la superposición de elementos que se presentan en los diversos planos de profundidad. De allí que es imperativo el empleo de cortes ultrafinos.

De manera resumida, los pasos necesarios en el procesamiento del tejido antes de ser observado al microscopio electrónico de transmisión son los siguientes :

1. Fijación: El tejido debe ser fijado, endurecido y preservado con tetraóxido de osmio (OsO4) y glutaraldehído, con un cuidadoso manejo del pH (con cacodilato de sodio), para mantener las membranas y las proteínas celulares en una malla tridimensional resistente. Los aldehídos crean puentes cruzados entre sí y enlaces covalentes con los grupos amino que estén libres en las proteínas. De esta manera se previene la degradación oxidativa por la muerte del espécimen.

2. Contraste: Las organelas y estructuras de interés deben ser electrón-densas y contrastar con el fondo (background). La electrondensidad se incrementa con el número atómico de los elementos y solo átomos pesados crean contraste. Se contrasta con tetraóxido de osmio, acetato de uranilo o citrato de plomo.

3. Deshidratación: El espécimen va a estar en el vacío y no puede contener agua, pues esta se evaporará y dispersará los electrones. El agua se elimina mediante alcoholes en grado creciente de concentración.

4. Inclusión: El espécimen deshidratado se coloca en óxido de propileno y resinas epóxicas o acrílicas, las cuales se endurecen y forman un bloque sólido de plástico muy duro.

5. Corte: Se emplea un ultramicrótomo que permite rebanar el tejido en cortes ultrafinos con una cuchilla de diamante, logrando cortes del orden de los 100 nm. Los electrones tiene un bajo poder de penetración y no es conveniente usar cortes gruesos.

Salud!!

[Diego Gonzalez]

Lleva más curro preparar una muestra que hacer un SEM casero.

Mis respetos a los que usan esos cacharros

Saludos

[pfdc]

Ok... creo que lo entiendo. El sensor es el mismo que en modo MEB. El accesorio es para dirigir los electrones que atraviesan la muestra y apantallar los reflejados. ¿Cierto?

Pero me sumo a la pregunta de Diego... ¿por qué platino y no óxido de magnesio, por ejemplo, que tiene una buena tasa de electrones reflejados?

Después de buscar información y estudiar cual seria el mejor material para el espejo no he conseguido ninguna conclusión así que he probado diferentes materiales.
El níquel, titanio y Cu/Be ( empleado en dinodos de fotomultiplicadores) son peores que el platino en todas las condiciones.

El tántalo y el wolframio son mejores (20%) que el platino para ángulos de incidencia altos ( 45- 90 º) , y mas o menos iguales para ángulos bajos (0- 45º). Como el espejo trabaja en ángulos bajos de momento no encuentro razones para cambiar el platino, ya que este sigue teniendo la ventaja de ser noble, lo cual no excluye que tal vez mas adelante pruebe con tántalo.

Salud!!