PROBLEMA CON MICROSCOPÍA

[ivangonzalezdavila]

Muy buenas.

Me estoy aficionando a la microscopía. Hasta ahora me habia dedicado a ver citologías y muestras ya preparadas, pero decidí meterme con el tema de Histología, preparar mis propias muestras.

Llevo un tiempo leyendo libros y distintas fuentes, pero el proceso histológico de tejidos no me funciona. Hago un corte de algún tejido y lo dejo en Formol 37% durante un día. Lo deshidrato con alcoholes crecientes: 45 minutos etanol 70%, 45m etanol 80%, 45m etanol 90%, 45m etanol 95%, 45 etanol-xilol, 45m xilol, 45m xilol. Luego lo meto en parafina fundida durante 15 minutos, saco la muestra parafinada y la meto en un molde con mas parafina. Una vez seco el molde, hago un corte fino (uso un microtomo que me construí manualmente, creo que los cortes salen relativamente finos así que yo considero que para empezar me sirve) y lo dejo flotar sobre agua templada. Después lo cojo con un porta y lo cuelgo con una pinza, boca abajo, a un hierro del horno de mi casa (es un horno de cocinar, por lo que la temperatura no es muy precisa, varía entre 65-90 grados). Después de 20 minutos, lo saco y lo meto en Xilol. ¡AQUÍ EL PROBLEMA! Cuando lleva un rato el porta en el xilol, los cortes se van despegando y caen al fondo. Lo he hecho varias veces y ninguno sobrevive a este paso. TODOS SE ACABAN DESPRENDIENDO

Agradecería si alguien con experiencia pudiese decirme a ver que puede ser. Lo hago todo bastante casero, no tengo un laboratorio. Por eso imagino que mi fallo se debe a algún apaño que hago. Entre ellos puede ser:

- No uso etanol 100% porque no tengo y es excesivamente caro.
- La parafina no la mantengo a temperatura constante. El baño de parafina lo hago con un mechero Bunsten debajo, intentando que se mantenga a una temperatura entre 65 y 80 grados.
- No uso horno desparafinador, sino horno casero
- El microtomo no es muy preciso, aunque aparentemente los cortes sí parecen finos

Estaría muy agradecido si me pudieseis ayudar. Gracias de antemano.

[pfdc]

Creo que la persona de este foro que te podría ayudar sin ninguna duda es Anajesusa, pero está de vacaciones y supongo que le queda una semana para que lo veamos de nuevo por aquí.
Salud!!

[exodia]

buenas, te paso el link de un foro que me dijo troglodita, muy interesante y donde encontraras un monton de cosas sobre microscopia (yo tambien he estado haciendo mis pinitos)
http://www.vidainvisible.com/foro/index.php

de todas formas por curiosidad, que estas haciendo ahora? tienes algunas ideas sobre preparaciones?
yo tambien me puse con la histologia y demas cosas, y hace poco y por suerte consegui un poco de agar-agar, para intentar hacer cultivos selectivos de bichejos.
he de decir que tu metodo es bastante completo ya que yo solamente deshidrato la muestra la tiño y la fijo (y no con muy malos resultados )

[fpc]

Hola
Tal vez esto te pueda ser de ayuda
http://www.angelfire.com/weird/medicine/histo1.html
Francisco

[El_Crazy_Xabi]

Unos cuantos comentarios

- Formol a pelo durante un dia? Al menos lo haras a 4° C? Lo maximo que se suele emplear en fijacion es un 4% en un buffer que tu decidas (PBS pej.) e incubar durante una noche. Despues de la fijacion tienes que eliminar el fijador (FA) lavando la muestra en buffer solo.
- Si no tienes siquiera etanol 99%... mal vamos. La sustitucion etanol-xileno no va a ser buena, vas a tener agua y va a dar problemas.
- Empezar con etanol al 70% va a producir artefactos a lo bestia es demasiado etanol de golpe. No se como de grande son tus muestras de tejido, pero se prefiere que sean lo mas pequeñas posible pues de ello va a depender el tiempo en etanol y xileno. Una serie recomendada para etanol seria 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, 100% etanol durante 10 min si la muestra es de 1x1x1 mm o menor. Los tiempos se incrementan exponencialmente con el tamaño de muestra
- Como pones los portas en xileno? Porque precisamente el xileno disuelve la parafina

Hace mucho que hice mis practicas en histologia y no he vuelto a preparar tejido en parafina, pero algunas partes del protocolo son generales para esto o microscopia electronica, y esa la tengo fresca

[nando]

Tienes que preparar los portas con albúmina de Mayer. Esto hará que no se despeguen.
Un saludo

[anajesusa]

Hola, creo que te han dicho todo, el alcohol absoluto es importante, no es tan caro, eso te dejará el material completamente deshidratado, una vez hecho el corte con el micrótomo, para la tinción hay que rehidratar, hacer el proceso inverso, pero para que quede pegado hay que preparar el porta con gelatina o albúmina, en plan casero podes probar pintar el porta con clara de huevo o gelatina sin sabor.
Acá hay un trabajo que hice en su día que puede interesarte http://anajesusa.wordpress.com/2010/03/ ... croscopia/

[ivangonzalezdavila]

Gracias por vuestra ayuda. Siento responder tan tarde, estaba fuera de España.

El_Crazy_Xabi, respecto a lo del Formol, yo suelo dejarlo 5 o 6 horas en Formol, aunque hay muestras que las dejo tiempo indefinido. He leído que para conservar muestras se dejan en Formaldehido y aguantan ahí semanas. No es asi? Y sobre lo del Xilol, yo lo tengo en un bote grande tapado e introduzco el porta verticalmente, dejándolo apoyado sobre las paredes interiores del recipiente. Se ve que poco a poco va desapareciendo la parafina, pero al rato se desprende toda la pieza de parafina (con muestra incluida) por sí sola. ¿Debería hacerme con una cesta metálica o algo por el estilo?

Respecto a lo del alcohol absoluto, a ver si lo encuentro y pruebo para ver diferencias.

Y a lo de la albúmina, gelatina, clara de huevo... no tenía ni idea, quizás sea eso lo que pueda ayudarme. De todas formas, ¿esas sustancias no entorpecen luego la visión ante el microscopio?

Saludos a todos.

[nando]

Te propongo este link sobre adhesivos. Yo solo he utilizado albúmina de Mayer, te garantizo que no se despegan los cortes ni interfiere en gran medida en la observación. El fenol o el timol son bactericidas, si preparas una pequeña cantidad y no pretendes conservar el resto no es necesario. La albúmina, yo echo una gotita, la extiendo con un cubre o un porta, como si fuese sangre, la dejo secar, coloco el corte encima y lo horneo 15 minutos a 40 grados.
Un saludo

[nando]

http://www.euita.upv.es/varios/biologia ... esivos.htm

Perdón no había pegado el link